金柑结合态多酚体外模拟消化产物的免疫活性研究
作者：文阅期刊网 来源：文阅编辑中心 日期：2022-10-14 09:03人气：
摘 要：目的本实验旨在研究金柑结合态多酚体外模拟消化产物的免疫活性。方法应用体外模拟消化模型和LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，分别采用DPPH法、ABTS法、CCK-8法、中性红比色法、Griess法以及Westernblot法，以RAW264.7细胞存活率、吞噬率和NO释放能力为指标，评价不同消化阶段和不同浓度下KNEPP的免疫活性。结果各消化阶段KNEPP抗氧化能力与KNEPP含量呈正相关。经口腔模拟消化，KNEPP含量为（1.51±0.40）mgGAE/gDW；经胃模拟消化，KNEPP含量为（1.74±0.40）mgGAE/gDW；经小肠模拟消化后，KNEPP含量为（1.62±0.05）mgGAE/gDW。体外模拟胃和小肠消化后的KNEPP处理细胞，其细胞存活率与KNEPP浓度呈现出的剂量依赖关系，且细胞存活率高于未消化的KNEPP和模拟口腔消化后的KNEPP。实验表明经不同模拟消化阶段的KNEPP处理后，LPS诱导的巨噬细胞吞噬功能均显著增强，并显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的释放量。Westernblot结果表明模拟胃和小肠消化阶段的KNEPP可显著抑制IKK和IκB-α的磷酸化，同时抑制NF-κB/p65表达，从而调节LPS诱导的巨噬细胞炎症反应，发挥抗炎作用。结论金柑结合态多酚体外模拟消化产物表现出来良好的免疫活性，这为KNEPP健康功效研究提供新的理论依据，为相关功能性产品的开发提供参考。
关键词:金柑;结合态多酚; RAW 264.7;免疫调节活性;抗炎;
STUDY ON THE IMMUNE ACTIVITY OF CONJUGATED POLYPHENOLS FROM KUMQUAT
IN VITO SIMULATED DIGESTION PRODUCTS
XIE Wen-ie ZHU Ya-wen XIAO Hang FAN Wei GUO Shi-yin QIN Jjing-ping TANG Zhong-
hai
College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University Department of Food
Science, University of Massachusetts
Abstract：Objective This study aimed to evaluate the immune activity of KNEPP. Methods In vitro simulated digestion model and LPS induced RAW264.7 macrophage inflammation model were used to evaluate the immune activity of KNEPP at different digestive stages and concentrations by using DPPH method,ABTS method,CCK-8 method,neutral red colorimetry,Griess method and Western blot method respectively,with RAW264.7 cell survival rate,phagocytosis rate and NO release capacity as indicators. Results The antioxidant activity of KNEPP at different digestion stages was positively correlated with the content of KNEPP. Simulated digesting through the oral cavity, stomach, and small intestine, respectively, KNEPP content was 1.51±0.4 mg GAE/g DW, 1.74±0.4 mg GAE/g DW and 1.62 ± 0.05 mg GAE/g DW. After the cells were treated with KNEPP at simulated oral and small intestine digestion, the cell survival rate was dose-dependent with KNEPP concentration. It was higher than that treated with undigested KNEPP and KNEPP at simulated oral digestion. Results showed that Phagocytosis of LPS-induced RAW 264.7 macrophages was significantly enhanced, and the release of NO was significantly inhibited, which were treated with KNEPP at different simulated digestion stages. In addition, the western blot result showed that KNEPP in simulated gastric and small intestinal digestion significantly inhibited the phosphorylation of IKK and IκB-α and inhibited the expression of NF-κB/ P65; thus, it plays an anti-inflammatory role in modulating inflammatory response induced by LPS. Conclusion KNEPP at vitro simulated digestion has an excellent immune activity, which provides a new theoretical basis for KNEPP health research and a reference for developing related functional products.
Keyword：kumquat; kumquat conjugated polyphenols (KNEPP); RAW264.7 macrophages; immuno-modulatory activity; anti-inflammation;
金柑作为一种药食兼用型水果[1]，具有抗氧化、抑菌、抗癌、调节免等多种功效[2]。金柑结合态多酚（kumquat conjugated polyphenols，KNEPP）上的邻位酚羟基易被氧化成醌类结构，其捕获自由基和消耗氧气的能力增强，从而能够激活相关的抗氧化活性酶系，诱导氧化的过渡金属离子螯合实现抗氧化[3,4]。相关研究表明，甜橙皮中橙皮苷、橙皮素、川陈皮素和桔皮素等酚类物质[5] 可以上调谷胱甘肽和抗氧化酶活性[6]，升高线粒体膜电位和Bcl-2/Bax的比率，抑制活性氧（ROS）和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）的产生[7,8] ；减少半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶-3的失活[9]。体内氧自由基产生过多会打破自由基生成和消除之间的动态平衡，造成生物膜结构异常，产生各类疾病[10]，而结合态多酚具有较强的抗氧化性以及清除过剩自由基的能力[11]。体外模拟消化的方法被广泛用于食品或药物经过消化后对疾病进行预防和治疗作用的研究，这种方便快捷的模型通常包括口腔、胃和小肠阶段，偶尔也有大肠发酵，通过模拟体内的生理条件，消化酶作用及胃肠道、pH值、消化时间和无机盐浓度等因素，来验证多酚类物质的活性。本实验选取KNEPP为原料，研究KNEPP及其消化后产物的抗炎症效果，为KNEPP的综合开发与利用提供一定的理论依据。
1 材 料 与 方 法
1.1 材料与试剂
1.1.1材料：
萃取游离多酚后金柑残渣，金柑为市售浏阳产的成熟金柑。
1.1.2试剂：
粘蛋白、胃蛋白酶、混合胰酶、胆盐、1,1-二苯基-2-三硝基苯胼（DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（美国Sigma）；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、无水碳酸钠盐酸、氯化钾、磷酸二氢钾、尿素等（分析纯）试剂（广州化学试剂厂）；小鼠腹腔RAW264.7巨噬细胞（中国科学院干细胞库提供）；DMEM高糖培养基（美国Hyclone）；PBS 缓冲液（pH 7.4，美国Gibco）；胎牛血清（杭州四季青）；青链霉素双抗（美国Gibco）；CCK-8（美国 Sigma- Aldrich ）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，美国Sigma- Aldrich）；中性红（美国Gibco）；NO试剂盒（上海碧云天）。
1.2 仪器与设备
KQ-500DE数控型超声波清洗器（昆山超声仪器）；多种规格移液枪（德国Eppendorf）；ML204电子天平（上海梅特勒-托利多）；WB-2000恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；H2050R 离心机（湖南湘仪）；EnSpir多功能酶标仪（珀金埃尔默）；CKX41倒置生物显微镜（日本OLYMPUS）；TC-2323 CO2培养箱（美国 SHELDON）；Ac2-4s1生物安全柜（新加坡艺思）
1.3方法
1.3.1 体外模拟消化模型：
（1）模拟口腔消化：人工唾液(SSF)的制备：NaCl(1.594 g/L)、NH4NO3 (0.328g/L)、KH2PO4(0.636g/L)、KCl(0.202 g/L)、K3C6H5O7·H2O(0.308g/L)、C3H5N4O3Na(0.198g/L)、H2NCONH2(0.198g/L)。
取10 g KNEPP，与7 ml SSF电解质储备液混合，加入1 ml含1500 U/ml 的α-唾液淀粉酶（3000 U /mg ）溶液，然后加入50 μl 0.3 mol/L CaCl2和1950 μl水充分混合，使其最终比例为10:10（W:V），控制pH在6.8左右，在恒温震荡仪中消化5 min。
（2）模拟胃消化：人工胃液(SGF)的制备：NaCl(2g/L)、HCl(7 ml/L)。将10 ml口腔消化后的液体样品与7.5 ml SGF电解质储备液，1.6 ml猪胃蛋白酶（3200～4500 U/mg）溶液混合，使其胃蛋白酶终浓度为25000 U/ml 即可，然后加入
5 μl 0.3 mol/L CaCl2和0.695 μl水，以及 0.2 ml 1mol/L HCl以达到pH 3.0，在恒温震荡仪中反应2h。
（3）模拟小肠消化：小人工肠液(SIF)的制备：NaCl(200g/L)、CaCl2·2H2O(36g/L)。将20 ml模拟胃消化后的液体与11 ml SIF电解质储备溶液，5.0 ml混合胰酶溶液（800 U/ ml）混合，加入2.5 ml胆盐溶液（50 mg/ml）和40 μl 0.3 mol/L CaCl2以及1.31 ml水，并用0.15 ml 1 mol/L NaOH调pH 为7.0，在恒温震荡仪中反应2h。
1.3.2 各阶段消化后KNEPP含量的测定：
参照Zou等[12]方法配置没食子酸标准液得到没食子酸标准曲线为y=54.386x+0.002（R2=0.9991），KNEPP含量以每克金柑（干重）所含有的没食子酸当量（mg GAE/g DW）来表示。
1.3.3 DPPH法：
样品的自由基清除能力参Kriengsak等[13]和Sreekala等[14]方法配置DPPH溶液和抗坏血酸溶液。
分别配制200、400、600、800、1000 μg/ml的KNEPP稀释液（对照组）、不同部位KNEPP的消化液，各取100 μl与等体积的DPPH溶液混合，以抗坏血酸为标准对照，在25 ℃下孵育30 min，在517 nm处测吸光值，计算出抗坏血酸溶液的标准曲线，DPPH自由基清除率按公式（1）计算
自由基清除率(%)=（1 -(Ai-Aj)/A0）×100 %（1）
Ao：空白对照组的吸光值，Ai：样品实验组的吸光值，Aj：样品对照组的吸光值
利用GraphPad Prism 8.0软件计算KNEPP和抗坏血酸半抑制浓度，分别表示为IC50（sample）和IC50（AA），并根据公式（2）计算出抗坏血酸当量AEAC，即每克样品干重所含的抗坏血酸量[15]。
AEAC（mg AA/100 g）=(IC50 AA)/(IC50 sample)×105（2）
1.3.4 ABTS法：
ABTS法参考Zheng等[16]和Masek 等[17]的方法配置ABTS工作。分别配制200、400、600、800和1000 μg/ml的KNEPP稀释液（对照组）、不同部位KNEPP的消化液，各吸取20 μl、200 μl的ABTS工作液混匀，在25℃下孵育 10 min，以抗坏血酸为标准对照，在734 nm处测定各孔的吸光度值，ABTS自由基清除率按公式（1）计算，再按公式（2）算出AEAC。
1.4 RAW264.7细胞生长的影响
1.4.1 细胞培养：
采用DEME培养基培养RAW264.7细胞，37℃、5%CO2培养至对数期。细胞抗增殖试验采用CCK-8方法[18]，收集对数期的RAW 264.7巨噬细胞，每孔细胞浓度为5×103/L，在CO2恒温培养箱中培养24 h后吸除上清液，设置含5～7个浓度梯度的实验组（含细胞、培养基、CCK-8、样品）、对照组（含细胞、培养基、CCK-8、无样品）、空白组（含细胞、CCK-8、无培养基、无样品），每孔完全培养基终体积为200 µl，CO2培养箱中孵育24 h，吸除上清液，每孔加入100 μl完全培养基配置的CCK-8溶液，CO2培养箱继续孵育4h后，于450 nm处测量各孔的吸光值。按公式（3）计算各阶段RAW 264.7细胞的存活率（Y）。
Y(%)=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100 %（3）
式中：As为实验组吸光度；Ac为对照组吸光度；Ab为空白组吸光度
1.4．2 中性红法检测不同多酚组分对巨噬细胞吞噬水平影响：
按照文献[19]方法并适当调整，将RAW 264.7巨噬细胞用刮刀轻轻刮下，吹打均匀96孔板中每孔加入100 μl 细胞浓度5×103/L的完全培养基，CO2培养箱培养24 h后，加入含不同浓度KNEPP和1 mg/L LPS的完全培养基200 μl，设置5～7个浓度梯度，以不含样品的培养基作为空白对照，每个浓度设置 5 个重复孔，于 37℃ CO2培养箱中孵育24 h后，弃上清，加入100 μl 0.05%的中性红溶液进行染色，1 h后吸出染色液，PBS清洗3次后每孔加入150 μl细胞裂解液，振荡混匀15 min，测定其在波长 550 nm 下的吸光度。细胞对中性红吞噬能力用吞噬指数（phago- cytic index，PI）表示，按公式（4）计算
PI=As/Ai%（4）
式中：As为实验组吸光度；Al为LPS组吸光度
1.4.3 Griess法检测各消化阶段KNEPP对细胞NO释放的影响：
按照文献[20]方法并做适当调整，用刮刀刮掉对数生长期的巨噬细胞，吹打均匀，96孔板中每孔加入100 µl 细胞浓度5×103/L的完全培养基，培养24 h。加入各消化阶段不同浓度的 KNEPP以及LPS的完全培养基200 µl，设置5～7个浓度梯度，以不含样品的培养基作为空白对照，模型孔只加LPS不加药物，每个浓度均设置5个复孔，处理24 h后，分别取100 µl各孔细胞上清液于另一96孔板中。将试剂盒中1 mol/L NaNO2溶液用完全培养基配制成2、5、10、20、40、60、80、100 µmol/L浓度的NaNO2溶液，加入96孔板中，每孔加入100 µl含NaNO2的培养基溶液，以不含样品的完全培养基作为空白对照，每个浓度设置5个重复。先加50 µl Griess A试剂，反应10 min，再加50 µl Griess B试剂，室温反应10 min后测定其在540 nm处的吸光度，计算每孔中NO2的量，即为上清液中NO生成量。
1.4.4 RAW264.7细胞蛋白提取：
吸取细胞培养基，用在4 ℃预冷的PBS清洗细胞一次，弃掉上清液。加200 µl RIPA裂解液，置于冰上，裂解10min，用细胞刮刀轻轻刮下细胞并收集细胞悬液，用超声破碎仪处理1.5 min；4℃，12000 r/min离心15 min。将离心后的上清液转移至1.5 ml的离心管中。
1.4.5 蛋白浓度检测：
配置BSA标准品：稀释液完全溶解蛋白标准品，浓度为2 mg/ml，依次将标准品溶液稀释到浓度为2、1、0.5、0.25、0.12、0.0625、0 μg/μl。配置BCA工作液：试剂A：试剂B按体积50:1配制。
加样：在96孔板中分别加25 μl稀释好的各浓度BSA标准品和样品和200 μl BCA工作液，于微量振荡器上轻微振荡混匀，放于37℃恒温培养箱反应30 min，酶标仪在550 nm处检测吸光值，绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
1.4.6 Western blot检测：
配制SDS-PAGE分析用凝胶，分离胶浓度为8%。将凝胶中的蛋白采用湿转法转移至PVDF膜上（恒压100 V，90 min），置5%的BSA溶液中封闭2 h，TBS清洗膜3次，每次10 min，分别加相应凝集素蛋白的一抗（iNOS、COX-2、p65、IκB-α、p-IκB-α、IKK、p-IKK，β-Actin），于4 ℃孵育12h。回收一抗，将膜用TBST洗膜3次，加二抗（HRP goat anti-mouse IgG，HRP goat anti-rabbit IgG），室温孵育1 h。回收二抗，用TBST洗膜3次，置于伯乐双通道凝胶成像系统中拍照。
1.5 数据处理
IC50的计算用GraphPad Prism 8.0软件；图表绘制GraphPad Prism 8.0软件，使用SPSS 25.0软件通过ANVOA分析数据并比较差异。用不同的小写字母表示不同组别间的显著性（P＜0.05），用不同大写字母表示同一组别不同水平间的显著性（P＜0.05）。每个样品重复3次，测试结果表示为平均值±标准偏差。
2 结 果
2.1 体外模拟消化对KNEPP含量的影响
利用没食子酸的标准曲线，计算释放的多酚含量。各消化阶段KNEPP含量如图1所示，其中对照组（未消化前的KNEPP含量）多酚含量为（1.53±0.60）mg GAE/g DW；经口腔模拟消化后，多酚含量为（1.51±0.40 ）mg GAE/g DW；经胃模拟消化后，多酚含量为（1.74±0.40 ）mg GAE/g DW，部分结合态多酚被释放；经过小肠模拟消化后，多酚含量为（1.62±0.05）mg GAE/g DW。
2.2 体外模拟消化后抗氧化活性评价
2.2.1 自由基清除能力测定：
各消化阶段KNEPP自由基清除能力如图2所示。
当浓度在200～400 μg/ml时，对照组和模拟口腔消化阶段KNEPP的DPPH清除率分别都在31 %左右，两组之间无明显变化，当KNEPP含量逐步增加，范围800～1000 μg/ml试DPPH清除率分别为59.2 %和57 %，分别增加了28 %和26 %。
经过胃模拟消化后，在200～400 μg/ml浓度范围内，DPPH清除率为57%，当达到1000 μg/ml时清除率可达到78%。根据表1中的IC50和AEAC值，可以确定经过不同消化阶段KNEPP的抗氧化能力为：模拟胃消化组＞模拟小肠消化组＞模拟口腔消化组=对照组。
2.2.2 阳离子自由基清除能力测定：
各消化阶段KNEPP自由基清除能力(图3)。在200 μg/ml时，对照组和模拟口腔消化阶段的KNEPP的ABTS清除率约30%，而模拟胃消化阶段的清除率约45%，小肠阶段则降低到38 %。当KNEPP含量范围增加到400～600 μg/ml时，对照组、模拟口腔阶段ABTS清除率都在45 %左右，模拟胃消化阶段的清除率为60.5 %，小肠阶段则降低到52.4 %，随着浓度增加各阶段清除率明显上升，胃消化阶段清除率高于其他消化阶段。当KNEPP浓度为1000 μg/ml时，对照组、模拟口腔阶段ABTS清除率都在50 %左右，模拟胃消化阶段的清除率为70.9 %，小肠阶段则为66.3 %，根据表2中的IC50和AEAC值，可以确定经过不同消化阶段KNEPP的抗氧化能力为：模拟胃消化组＞模拟小肠消化组＞模拟口腔消化组=对照组。
2.3 不同消化阶段组分对RAW 264.7细胞生长的影响(图4)
当各消化阶段KNEPP浓度≤100 μg/ml时，RAW 264.7细胞的存活率仍在89%以上；在KNEPP质量浓度为200 μg/ml时，对照组和模拟口腔消化组的细胞存活率下降至约76%，但模拟胃和小肠消化组的细胞存活率依然为86.7%和82.79%；而当KNEPP浓度在400～1000 μg/ml范围内时，对照组和模拟口腔消化组的细胞存活率逐渐降低到10%，模拟胃和小肠消化组的细胞存活率分别为54.9%和43%。
2.4 不同消化阶段KNEPP对RAW 264.7细胞吞噬水平影响(图5)
与空白组比，LPS能显著刺激巨噬细胞吞噬中性红。将 LPS组吞噬指数视为100 %并与之相比。当浓度为50 μg/ml时，未消化KNEPP组、模拟口腔消化组组的吞噬指数和LPS组相近，不具备统计学差异（P＞0.05），模拟胃消化组和模拟小肠消化组吞噬指数分别为108%和105%，略高于LPS组。浓度为100 μg/ml时，未消化KNEPP组、模拟口腔消化组的吞噬指数无明显变化，分别为97%和93.7%，模拟胃消化组和模拟小肠消化组吞噬指数分别为121%和120%，吞噬能力显著增强。浓度为200 μg/ml时，各消化阶段吞噬指数均有所上升，其中模拟胃消化阶段吞噬指数最高为145%。
2.5 不同消化阶段KNEPP对RAW 264.7细胞NO释放的影响(图6)
经LPS刺激后的RAW 264.7巨噬细胞，上清液中NO的释放量显著增加（P＜0.01），这表明炎症模型建模成功。将 LPS组分泌的NO量视为100 %并与之相比。当浓度为50 μg/ml时，未消化KNEPP组、模拟口腔消化组和模拟小肠消化组的NO生成量和LPS组相近，都在84%左右，模拟胃消化组NO分泌量为74%，抑制NO生成的能力高于其他三个组。浓度为100 μg/ml时，未消化KNEPP组、模拟口腔消化组和模拟小肠消化组的NO生成量分别为72.16%、70.71%、70.33%；浓度为200 μg/ml时，以上三组NO生成量分别为57.58%、54.88%、51.93%。
2.6 不同消化阶段KNEPP对RAW 264.7细胞各蛋白水平表达的影响(图7)
未经LPS处理的iNOS和COX-2表达非常低，而LPS处理的iNOS和 COX-2表达分别降低了33% 和30%；未消化的KNEPP和模拟口腔消化的KNEPP，蛋白条带印迹有变浅趋势，可抑制iNOS和 COX-2表达；模拟胃和小肠消化的KNEPP蛋白条带印迹明显变浅，表达量显著降低50% 。
胃和小肠消化后的KNEPP作用更显著（P＜0.05），p-IκB-α表达降低了62.5 % 左右；经过模拟胃和小肠消化的KNEPP处理可显著降低巨噬细胞IKK的磷酸化（phosphorylated IKK，p-IKK）（P＜0.05）水平，蛋白印迹逐渐变浅，p-IKK表达分别降低50%和48%。p65蛋白印迹有减弱趋势，经过口腔消化的KNEPP蛋白表达量降低15%，经过模拟胃和小肠消化后KNEPP抑制蛋白表达量降低50%。
3 讨 论
KNEPP以酯、苷和聚合物的形式存在于食物中，通过非共价键（氢键、疏水作用力、离子键）和共价键（酯键）与蛋白质、多糖形成复合物[21]，胃肠道中的胃蛋白酶、胰酶和胆汁等物质可以破坏KNEPP与蛋白质、多糖等之间的共价键，使酚类物质释放。由于食物在口腔中停留时间过短，唾液淀粉酶，粘蛋白等与其作用不充分无法破坏结合太多酚结构，因此在模拟口腔消化阶段，KNEPP的含量无明显变化。当酚类物质到达模拟胃液后，较低的pH值可以降低食糜的粒径[22]，破坏酚类物质与蛋白质、多糖之间的非共价键，使酚类复合物分解，有利于多酚的释放；另一方面，KNEPP包含大量具有高聚合度的原花色素，它们在较低的pH值下水解，此水解过程可能提高了结合态多酚的水溶性[23]。而当KNEPP到模拟小肠消化阶段时，因肠液为碱性，易导致去糖基化、葡萄糖醛酸化、甲基化、磺化以及类黄酮的羟基化等化学变化，尤其是KNEPP中主要的多酚类物质黄烷醇，由于结构不稳定而发生降解，从而导致多酚的释放量减少[24]。
DPPH结构中有三个苯环，中心氮原子上有一对孤对电子，可稳定存在于有机溶剂中，当DPPH与抗氧化剂反应时，自由基中的孤对电子与抗氧化剂中的氢原子配对，使溶液的吸收强度逐渐减弱或完全消失，溶液颜色由深紫色退至黄色，其褪色程度和接受的电子数量存在定量关系，反应可以通过酶标仪监测[25,26]。ABTS以水溶性自由基为显色剂，向其中加入KNEPP，ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+ ，如果KNEPP中存在抗氧化成分，则会与ABTS+发生反应使反应体系褪色[27]，反应程度可以通过酶标仪检测。本研究表明金柑结合态多酚提取物能有效清除DPPH自由基、ABTS阳离子，具有良好的抗氧化能力。在模拟胃消化阶段，KNEPP的消化产物的抗氧化能力最强，这说明酸性条件相比于碱性条件更能提高KNEPP的抗氧化能力。
巨噬细胞是否发挥免疫功能基于其生存状态，因此巨噬细胞存活率直接影响其功能特性和免疫反应[28]。本实验中，经胃和小肠消化后的KNEPP的毒性相对于同浓度下的对照组和模拟口腔消化组得到了缓解，这进而说明经胃和小肠消化后的KNEPP有利于促进巨噬细胞的生长也能提高其吞噬能力，增加其抗炎能力，保护机体免受抗原感染。
NO是一种重要的炎症因子,具有一定的细胞毒性，在炎症性疾病的发病过程中，巨噬细胞活化后，NF-κB和STAT1信号通路会被激活，进而导致NO合酶的增加，NO释放量增加，引起氧化损伤、细胞变性和组织粘连，同样也会加重体内的炎症反应[29]。本实验中，浓度为200 μg /mL的各消化阶段KNEPP能够显著抑制NO的生成，且呈浓度依赖性。而在100～200 μg /ml浓度范围内，模拟胃消化组对NO生成量的抑制效果明显强于其他三组。结果表明，KNEPP可以有效抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞中NO的产生，并提高其抗炎能力，这进一步表明KNEPP在胃消化后释放出更多的多酚，从而增强了其抗炎能力。
当LPS刺激单核细胞分化的巨噬细胞时，核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶信号通路可激活炎症相关基因表达，被激活的NF-κB易位到细胞核，结合到目标基因的启动子区域，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS），环氧合酶-2（COX-2）[30]，同时细胞损伤导致这些关键的酶活化，引发免疫反应。当巨噬细胞RAW 264.7未被激活时，NF-κB与其抑制剂IκB结合于细胞质中，由于IκB的抑制作用，NF-κB不具有活性。当巨噬细胞RAW 264.7受到活化因子的刺激时，细胞表面TLRs、MyD88等受体传导、诱导细胞内IKK磷酸化，并作用于NF-κB-IκB复合体，使IκB磷酸化，同时脱落并分解释放NF-κB，使NF-κB恢复其生理活性，其p65亚基通过核膜易位到细胞核，特异性结合到染色体κB序列后，促进一系列免疫因子的表达，参与随后的免疫调节和炎症反应[31]。
RAW 264.7细胞在LPS刺激下，不同消化阶段吞噬功能均有显著增强。此外，通过Western Blot检测验证了各消化阶段KNEPP可以抑制各炎症蛋白的表达，其中模拟胃和小肠消化阶段的KNEPP抑制作用较为显著，既可以抑制IKK发生磷酸化作用，又同时抑制IκB-α的磷酸化进而抑制NF-κB/P65的表达，进一步提高免疫作用和抗炎能力。
综上所述，本实验结果初步表明金柑结合态多酚提取物具有良好的免疫活性，具有一定的研究价值。
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