双荧光素酶报告基因验证微小RNA410对白细胞介素-13基因的靶向调
作者：admin 来源：未知 日期：2021-04-02 08:53人气：
摘 要：
目的:验证微小RNA410(miR-410)对白细胞介素-13(IL-13) mRNA的靶向调控作用。方法:采用生物信息学软件预测miR-410与IL-13 mRNA 3’端非翻译区存在结合位点，设计并合成包含miR-410结合序列及突变序列的IL-13基因序列片段，分别构建野生型和突变型双荧光素酶基因载体，与miR-410和阴性对照序列共同转染293T细胞，检测转染后荧光素酶的活性，验证miR-410对IL-13 mRNA表达的影响。结果:生物信息学显示，IL-13 mRNA存在与miR-410的结合位点。基因测序结果显示，野生型和突变型荧光素酶报告基因载体构建成功。通过双荧光素酶报告系统发现，miR-410能够结合野生型IL-13 mRNA荧光素酶基因序列从而抑制其表达，而对突变型IL-13 mRNA的荧光素酶表达无影响(P<0.05)。结论:miR-410可以靶向调控IL-13mRNA的表达。
关键词：
微小RNA410 白细胞介素-13 双荧光素酶报告基因
Targeted Regulation Role of MicroRNA410 in Expression of Interleukin-13 Detected by Dual-Luciferase Reporter System
Jin Rong Liu Dongyun Hu Sujuan Lin Rongjun
The Affiliated Hospital of Qingdao University;
Abstract：
Objective: To verify the targeted regulation role of microRNA410( miR-410) on expression of interleukin-13( IL-13 mRNA. Methods: The binding sites of miR-410 in 3'untranslated region( 3'UTR) of IL-13 mRNA were predicted by the bioinformatics software. IL-13 gene fragments binding miR-410 and mutant sequences were designed and synthesized. The wild and mutant luciferase reporter gene carriers were respectively constructed. miR-410 mimics or negative control of mimics were respectively co-transfected into293 T cells with wild or mutant luciferase reporter gene. The luciferase activity was detected to observe the effects of miR-410 on expression of IL-13 mRNA. Results: Bioinformatics analysis showed that there was binding site located in 3'UTR of IL-13 mRNA. The electrophoresis showed that the wild and mutant luciferase reporter gene carriers were constructed successfully. Through the dualluciferase reportier system,it was found that miR-410 could bind the wild-type IL-13 mRNA luciferase gene sequence and inhibit its expression,but had no effect on the mutant IL-13 mRNA luciferase expression( P<0. 05). Conclusion: IL-13 mRNA can be targeted by miR-410.
Keyword：
microRNA410; interleukin-13; dual-luciferase reporter system;
微小RNA(miRNA)是真核生物中一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码RNA，具有高度保守性、时序性和组织特异性，主要通过与靶基因mRNA的3’UTR上的互补区域结合，在转录后水平负性调控靶基因的表达，参与生物的发育、增殖、分化、凋亡过程[1-3]。哮喘是一种遗传易感性的慢性气道炎症性疾病，涉及多种细胞、细胞因子以及与免疫调节密切相关的信号通路[4]。越来越多的研究证据表明，多种miRNA参与哮喘的气道炎症调节[5]。本课题组前期研究发现，鸡卵白蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠体内微小RNA410(miR-410)含量较对照组明显降低，考虑miR-410可能参与哮喘发病过程。本研究拟通过生物信息学方法预测miR-410与IL-13基因的结合位点，并通过双荧光素酶报告系统验证miR-410对IL-13基因的直接靶向关系，为进一步探索miR-410在哮喘发病机制中的作用提供参考。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂
双荧光素酶检测系统、psi CHECK-2(promega);多功能酶标仪(Spectra Max i3x,Molecular Devices);凝胶成像系统(Tanon-1200，上海天能科技有限公司);大肠埃希菌菌株DH5α、293T细胞、miR-410模拟物和miRNA无义序列阴性对照、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];IL-13目的基因序列和突变序列(Invitrogen);限制性内切酶Xho I和Not I、T4 DNA连接酶、DNA ladder (Fermentas);质粒DNA抽提试剂盒(Qiagen);KOD高保真酶PCR试剂盒、Taq酶(TOYOBA)。
1.2 方法
1.2.1 生物学信息预测
利用靶基因预测软件targetscan对miR-410靶向结合IL-13 3’UTR的位点进行分析，结合位点见图1。
1.2.2 双荧光素酶报告载体的构建和鉴定
分别化学合成IL-13 mRNA结合位点的野生型和突变型序列的正义链和反义链，目的片断插入Xho I、Not I位点。用Xho I、Not I 37℃酶切psi CHECK-2载体回收线性化载体片段。目的基因片段与线性化载体连接，将连接产物转化感受态细胞，筛选质粒克隆，提取质粒DNA，分别进行酶切鉴定及测序鉴定。
1.2.3 细胞转染
事先准备好用于转染的分到96孔板中的293T细胞和目的质粒。将10μL DMEM与0.16μL的psi CHECK-IL-13-wt/mut目的质粒以及miR-410-3p/Negative Control(NC)充分混匀后室温放置(溶液A)，之后将10μL DMEM与0.3μL的转染试剂充分混匀(溶液B)，室温放置5 min。将溶液A与溶液B充分混匀，室温放置20 min。转染前为细胞换取新鲜培养基，之后将转染混合物加入混匀。37℃、5%CO2培养。转染6 h后换取新鲜培养基，转染48 h后收集细胞检测。
1.2.4 荧光素酶报告基因验证
以96孔板每孔100μL的量加入细胞悬液，室温摇床上缓慢摇15 min后，将细胞裂解液吸至1.5 m L离心管，4℃12 000 r/min离心10 min，取上清液移入新的管子;96孔板中加入Luciferase Assay ReagentⅡ(LARⅡ)工作液100μL，加入20μL细胞裂解液，移液枪吹打混匀2～3次，测定记录Firefly luciferase (Fl)值(内参值)。加入100μL Stop&Glo Reagent，移液枪吹打混匀2～3次，测定记录Renilla luciferase(Rl)值，即为报告基因发光值。
1.3 统计学方法
应用SPSS 22.0软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 荧光素酶报告基因载体酶切分析
psi CHECK-IL-13-wt/mut质粒提取后应用Xho I、Not I双酶切，结果psi CHECK-IL-13-wt/mut在相应片段大小的位置切出来载体条带和目的DNA片段，释放出约500 bp大小的片段。见图2。
2.2 荧光素酶报告基因测序分析
将含有miR-410结合位点的野生型和突变型序列的IL-13 mRNA载体进行测序，结果表明野生型和突变型IL-13 mRNA荧光素酶报告载体均构建成功。见图3。
图2 psi CHECK-IL-13-wt/mut质粒的酶切鉴定
图3 psi CHECK-IL-13-wt/mut质粒酶切产物测序
2.3 荧光素酶活性测定
将miR-410模拟物与野生型载体psi CHECK-IL-13-wt共转染293T细胞后，细胞荧光素酶活性明显下降，与突变型载体psi CHECK-IL-13-mut比较差异有统计学意义(t=5.697,P<0.01);与对照组NC结合野生型psi CHECK-IL-13-wt载体比较，荧光素酶活性降低(t=2.852,P<0.05)。见图4。
图4 荧光素酶活性测定
3 讨论
支气管哮喘(简称哮喘)是由包括嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等多种细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[6]。近年来miRNAs在哮喘发生发展中的作用引起众多关注。miRNA是一种由18～25个核苷酸组成的非编码RNA，其功能强大，能够通过与靶基因mRNA的非编码区的结合位点结合并参与基因转录后的调控和基因的降解[7]。越来越多的研究发现miRNA在哮喘发病机制中具有重要作用[8-10]。Williams A E等[11]发现，哮喘患者肺组织中miR-92、miR-26a、miR-200c、miR-16、let-7b、miR-125、let-7及miR-26的含量与正常对照组存在差异。Kumar M等[12]研究证实，let-7在缓解哮喘气道炎症、降低气道高反应性、防止黏膜上皮细胞化生及上皮细胞纤维化方面的作用。本课题组前期研究显示，miR-410在OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型中的表达水平明显低于对照组小鼠，提示miR-410可能参与过敏性哮喘的发病过程[13]。
在过敏性哮喘的发生发展过程中，Th2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13对炎症细胞如巨噬细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞的浸润起到重要作用[14-16]。IL-13主要由Th2细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞在活化状态下分泌。IL-13诱导B淋巴细胞合成大量的Ig E抗体同时增加嗜酸粒细胞的募集，引起气道上皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶(i NOS)，诱导黏液产生和杯状细胞增殖，刺激气道平滑肌收缩，提高细胞外胶原蛋白和纤维母细胞向成肌纤维细胞表型转变等[17]。IL-13能够通过IL-13Rα1与IL-4R形成受体复合物，参与信号转导，激活靶基因转录，诱导Th0细胞分化、气道炎症、气道高反应、黏液产生。IL-13主要通过气道上皮细胞、平滑肌细胞来调节哮喘个体小气道嗜酸粒细胞的募集[18]。抑制Th2型细胞因子，特别是IL-13的促炎作用是哮喘免疫治疗的一个发展方向[19]。目前已经开发出抗IL-4抗体、抗IL-5抗体以及抗IL-13抗体等抑制相关炎症因子的单克隆抗体[20]。相关研究[21-22]发现，抗IL-5抗体及抗IL-13抗体组可明显抑制OVA诱导的哮喘小鼠肺部嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润。但是单克隆抗体制作工艺相对较长，还存在安全、免疫原性等一系列问题[23-24]。因此，从哮喘发生机制靶基因方面，本研究试图探讨某种靶向治疗哮喘Th2因子相关的药物，从而阻断过敏性哮喘的发生和发展。本研究发现，miR-410在体外试验方面能够抑制IL-13 mRNA荧光素酶载体的荧光素活性，证实了miR-410能够靶向调控IL-13 mRNA。
本研究通过生物信息学软件targetscan预测发现了IL-13 3’UTR存在可能被miR-410结合的潜在靶点，通过构建psi CHECK-2双荧光素酶报告基因载体，从体外试验层面验证了miR-410对IL-13 mRNA的靶向结合作用，提示miR-410能够靶向调控IL-13 mRNA，从而影响其转录及表达。本研究确定了miR-410和IL-13 mRNA的靶向调控关系，为进一步在体内试验层面上研究其在哮喘发病中的作用奠定了基础。
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